PCR儀校準(zhǔn)是實(shí)驗(yàn)中一定要去做的事情，一個(gè)穩(wěn)定的溫度循環(huán)是成功實(shí)現(xiàn)PCR所必需的。其中溫度控制的動(dòng)、穩(wěn)態(tài)特性是影響PCR擴(kuò)增結(jié)果正確與否的重要因素之一, 這包括溫度準(zhǔn)確性、升降溫速度、溫場(chǎng)均勻性、大超調(diào)溫度。

　　PCR就是利用DNA聚合酶對(duì)特定基因做體外或試管內(nèi)In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來(lái)的一百億至一千億倍。根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀四類。

　　PCR儀校準(zhǔn)的項(xiàng)目有以下幾點(diǎn)：

　　一、溫度準(zhǔn)確性

　　溫度準(zhǔn)確性是PCR儀重要的性能指標(biāo)，如溫度準(zhǔn)確性低可直接造成非特異性擴(kuò)增，甚至是錯(cuò)誤的擴(kuò)增結(jié)果，造成假陽(yáng)性和假陰性。

　　市場(chǎng)上各家廠商考核基因擴(kuò)增儀PCR儀性能的主要指標(biāo)，一般廠家的企業(yè)指標(biāo)為±0.5℃，一些性能較好的產(chǎn)品可以實(shí)現(xiàn)的溫度準(zhǔn)確度為±0.3℃。故需對(duì)PCR儀控溫準(zhǔn)確度進(jìn)行測(cè)試。校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)平均溫度的計(jì)算公式為：I—參加檢測(cè)的溫度探頭序號(hào)；n—參加檢測(cè)的溫度探頭的數(shù)量

　　二、溫場(chǎng)均勻性

　　由于PCR儀加熱器加熱不均勻，導(dǎo)致PCR儀模塊上各孔存在一定溫差。造成試驗(yàn)結(jié)果偏差。一般PCR儀邊緣點(diǎn)的溫度低于中間區(qū)域，所以均勻性為PCR儀重要的性能指標(biāo)。一般廠家的企業(yè)指標(biāo)規(guī)定均勻性為±0.5℃，一些性能較好的產(chǎn)品可以實(shí)現(xiàn)的溫度均勻度為±0.3℃。

　　校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過(guò)選取孔板中16個(gè)特殊反應(yīng)位置來(lái)測(cè)量溫度，并得出孔板的溫度均勻性。均勻性為各個(gè)探頭在同一時(shí)刻大溫度與小溫度的差值。均勻度計(jì)算公式為：tmax-tmin  tmax =大溫度；tmin =小溫度

　　三、升降溫速率

　　PCR儀校準(zhǔn)中擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量的多少?zèng)Q定了PCR的效率。為了在短時(shí)間內(nèi)獲得盡可能多的產(chǎn)物，需要儀器在升降溫段具有按照預(yù)設(shè)升降溫速率快速升溫和降溫的能力大升溫速率達(dá)15~20℃。一個(gè)完整的PCR過(guò)程，是由若干個(gè)升溫→恒溫→降溫循環(huán)構(gòu)成的。因?yàn)?ldquo;變性”，“退火”和“延伸”3個(gè)階段是必須要保證的。

　　因此，只有使升降溫的過(guò)程盡可能地迅速，才能縮短每個(gè)PCR循環(huán)以及整個(gè)PCR 過(guò)程所需時(shí)間。一般廠家的企業(yè)指標(biāo)規(guī)定升溫速率為±3℃/sec。儀器校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，升溫速率為溫度從40℃到90℃的時(shí)間；降溫速率為溫度從70℃到35℃的時(shí)間。

　　四、大超調(diào)溫度

　　當(dāng)溫度從一定點(diǎn)溫度調(diào)節(jié)到另一定點(diǎn)溫度,就會(huì)產(chǎn)生溫度的超調(diào)。超調(diào)溫度過(guò)大同樣會(huì)對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生影響，所以校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要計(jì)算大超調(diào)溫度和平均超調(diào)溫度。